Микроскопы Labor-Microscopes
Разработка и производство микроскопов
онлайн заказ   подобрать микроскоп
 (812) 933-25-78
labomed@list.ru
Немного о нас

Биологические микроскопы. Недостатки визуального наблюдения по полю от центральной зоны к периферии и пути их устранения.

ч.1 Ахроматические и апохроматические объективы больших увеличений.

Очевидными недостатками при визуальном наблюдении по полю в биологический микроскоп, где используются обычные ахроматические или апохроматические объективы, являются кривизна и окраска в изображении элементов структур исследуемых объектов.

1. Кривизна изображения. Обнаруживается при использовании в простых биологических микроскопах, в том числе, короткофокусных объективов, использующих линзы с крутыми сферическими преломляющими поверхностями. Чем меньше значение фокусного расстояния объектива, тем больше величина кривизны даваемого им изображения. При исследовании (при применении короткофокусных объективов) объекта от центра к периферии поля аберрация кривизны изображения вызывает необходимость перефокусировки микроскопа. При этом, изображение получается резким лишь в центре поля или в каком-либо его круговом сегменте, в остальных зонах оно не резкое. Наблюдатель чувствует дискомфорт, который особенно ярко проявляется при точной фокусировке микроскопа на край поля, когда достаточно большая его центральная часть получается нерезкой. Следует сделать важное замечание, что кривизна в изображении исследуемого объекта не вносит искажений в его структуру и форму, т. е при перефокусировке микроскопа и достижении резкости на любом участке поля (даже на периферии) информация об исследуемом фрагменте объекта остаётся достоверной.

Обратимся к объекту, который, требуется исследовать на биологическом микроскопе. В общем случае это препарат — тонкий срез материи или мазок, который одной своей плоскостью наклеен на предметное стекло, а второй заклеен покровным стеклом. Заметим, при рассмотрении технических аспектов микроскопирования объект — это именно сочетание всех перечисленных «компонентов». Очевидно, в пределах линейного поля от центра к периферии этот объект не будет «однородно» плоским. Микроскописты знают, что в объекте различные фрагменты, подлежащие исследованию, как правило, располагаются на различной высоте от предметного стекла. При сравнении величины разброса расположения со значением глубины резкости применяемого объектива, оказывается, что они соизмеримы для объективов слабых и средних увеличений и величина разброса на порядок больше значения глубины резкости высокоапертурного объектива большого увеличения. Отсюда вытекает необходимость столь распространённого просмотра объекта «в глубину» (посредством перефокусировки микроскопа). Также свой вклад в ошибку плоскостности объекта, вносят реальная клиновидность «слоёного пирога» (предметное стекло, клей, собственно препарат, клей, покровное стекло), и несовершенство осветительной системы простого микроскопа.

Вызывает интерес рассмотрение вопроса о целесообразности исправления аберрации кривизны или, точнее, степени её исправления в короткофокусных объективах с ахроматической и апохроматической коррекцией, используемых в биологических микроскопах для визуального наблюдения. Как правило, в стандартной комплектации это иммерсионные объективы большого увеличения (50х-100х) и числовой апертуры 1.00ми – 1.30ми. Такие объективы имеют расчётное значение кривизны в изображении 15-30мм. При использовании таких объективов на микроскопе при визуальном наблюдении приходится перефокусироваться 2-4 раза при исследовании изображения от центра к периферии по полю. И это с учётом естественной способности глаза наблюдателя к аккомодации. Будем учитывать, что в практической микроскопии объективы большого увеличения и числовой апертуры не используется в качестве обзорных. Выбор участка для последующего «тонкого» исследования осуществляется при использовании объективов малого или среднего увеличения, и только потом используется высокоапертурный объектив большого увеличения, как правило, иммерсионный. При этом естественное стремление исследователя по приведению фрагмента изображения исследуемого объекта в центральную зону видимого линейного поля обеспечивает не только комфорт, но и максимальную достоверность исследования.

Существует техническая возможность компенсации аберрации кривизны в плоскости промежуточного изображения на микроскопе, если эта аберрация не исправлена в объективах. Требуется добавление в схему микроскопа соответствующего компенсатора. Однако в этом случае для каждого объектива из комплекта микроскопа потребуется использование своего компенсатора, что вызывает неудобства в работе и представляется практически не целесообразным. Известен также метод компенсации аберрации кривизны уже после плоскости промежуточного изображения — с помощью окуляров, он использовался в старых микроскопах ф. Leitz [1], однако, и он не нашёл широкого распространения (по той же причине — каждому объективу требуется свой окуляр). Кроме того, отсутствуют экспериментальные данные, положительные отзывы микроскопистов об эффективности применения данного метода, что не позволяет рекомендовать его при проектировании новых микроскопов.

Учитывая, что значение полного увеличения на микроскопе складывается из произведения увеличения объектива на увеличение окуляра (если другие элементы отсутствуют), рассмотрим два возможных сочетания при выборе объектива и окуляра для визуального наблюдения на биологическом микроскопе. Можно использовать ахроматический объектив 100х с числовой апертурой 1.25ми и комплектовать его окуляром 10х/18. Тогда полное увеличение на микроскопе составит 1000х, линейное поле на объекте составит 0.18мм, а величина аберрации кривизны в плоскости промежуточного изображения на микроскопе составит примерно 25-30мм. Однако, при естественном стремлении к уменьшению кривизны исследователь отдаёт предпочтение другому сочетанию объектив – окуляр, а именно, ахроматический объектив 50х с числовой апертурой 1.25ми в комплекте с окуляром 20х/9. Полное увеличение на микроскопе также составит 1000х, линейное поле на объекте будет таким же, а вот величина аберрации кривизны в плоскости промежуточного изображения на микроскопе будет в два раза меньше. Однако, оговоримся, что проведённые теоретические исследования показали, что наилучших условий при визуальном наблюдении на микроскопе можно добиться, применяя окуляры именно увеличений 10х – 12.5х [2].

Выводы:

  • Имеется принципиальная техническая возможность полной компенсации аберрации кривизны изображения в биологическом микроскопе при использовании обычных ахроматических или апохроматических объективов больших увеличений и максимальных числовых апертур. Однако, для визуального наблюдения в микроскоп, учитывая априорные отклонения от плоскостности самого исследуемого объекта, вряд ли, это целесообразно. Следует брать в расчёт особенности исследуемых объектов, методики их приготовления, и учитывать практику реальной работы на микроскопе.
  • Значение числовой апертуры (а не линейного увеличения объектива) является основным критерием для определения целесообразности и требуемой степени исправления аберрации кривизны в объективах комплектующих биологический микроскоп.

2. Хроматическая разность увеличений (ХРУ). В общем толковании речь идёт об окраске в изображении элементов структур исследуемых объектов при проецировании их объективами средних и больших увеличений. Влияние ХРУ на результирующее качество изображения в микроскопе, в отличие от других типов хроматических аберраций, таких как хроматическая разность положения (ХРП), вторичный спектр (ВС), является наименее исследованным, хотя природа её возникновения та же - различная сила преломления лучей в разных цветах рабочего спектрального диапазона. Характер исправления ХРП и ВС в оптической системе конкретного объектива (и микроскопа), не вызывает особого интереса они либо исправлены, либо нет, в зависимости от класса объектива, сложности его оптической конструкции. Сделаем, однако, замечание, что полное исправление аберрации ВС в объективах, предназначенных для визуального наблюдения на микроскопе, не всегда представляется целесообразным. Теоретическая чувствительность человеческого глаза к свету снижается в спектральном диапазоне ближнего УФ диапазона, поэтому для визуального наблюдения на биологическом микроскопе полное исправление аберраций для длин волн этого спектрального диапазона лишено практического смысла. Другое дело, аберрация ХРУ, которая может оставаться не исправленной даже при исправленных ХРП и ВС, и даже при использовании достаточно сложных оптических конструкций объективов.

Очевидно, аберрация ХРУ, если её не исправлять специально, связана со значением линейного увеличения объектива, чем больше увеличение, тем больше значение ХРУ. Поэтому она незначительна в объективах малых и даже средних увеличений. Сильное влияние этой аберрации обнаруживается в объективах больших увеличений. На краях фрагментов изображений появляется радужная кайма, наблюдаемая по всем контурам. Особенно хорошо это видно, если использовать в качестве исследуемого объекта какую-нибудь регулярную структуру, шкалу или сетку. Контуры элементов регулярной структуры будут иметь окраску, тем более сильную, чем больше значение линейного увеличения объектива. При этом величина ХРУ объектива в пределах всего линейного поля от центра к периферии практически одинакова. Приведённая ниже фотография шкалы объект-микрометра иллюстрирует окраску по контуру всех элементов.

шкала фокусировкиСледует сделать важное замечание, что аберрация ХРУ в изображении исследуемого объекта вносит искажения в его структуру и форму, и при перефокусировке микроскопа при наблюдении от центра поля к периферии на любом его участке информация об исследуемом фрагменте объекта не будет достоверной. Таким образом можно сделать вывод, что эта аберрация должна исправляться на микроскопе полностью или хотя бы частично.

Существует техническая возможность компенсации аберрации ХРУ в плоскости промежуточного изображения на микроскопе, если эта аберрация специально не исправлялась в объективах. Требуется добавление в схему микроскопа соответствующего компенсатора — «фокусирующей тубусной системы». Однако в этом случае для каждого объектива из комплекта микроскопа потребуется использование своего компенсатора, что вызывает неудобства в работе и представляется практически не целесообразным. Известен также метод компенсации аберрации ХРУ уже после плоскости промежуточного изображения - с помощью специальных компенсационных окуляров, он широко применялся в разработках 50х годов прошлого столетия практически всеми ведущими производителями микроскопов [3]. Для унификации все объективы комплекта рассчитывались таким образом, чтобы остаточная аберрация ХРУ составляла 2%. В современном понимании такой метод нельзя признать оптимальным, а наиболее логичным и естественным решением является исправление аберрации ХРУ в объективе. Приведённая ниже таблица иллюстрирует варианты подходов к исправлению ХРУ на микроскопе и прогноз результирующего качества изображения, а также выводы о возможности свободной комплектации микроскопов унифицированными узлами объективов и окуляров.

Составляющие элементы визуальной части оптической системы современного микроскопа Результирующее качество изображения   Вывод
Объектив Фокусирующая тубусная система Окуляр с сеткой или шкалой
         
Не исправлена ХРУ=(1.5-2)% Отсутствует или исправлена ХРУ=0% Компенсационная
ХРУ=(1.5-2)%
 Элементы сетки или шкалы окрашены Невозможна свободная комплектация
Не исправлена ХРУ=(1.5-2)% Компенсационная
ХРУ=(1.5-2)%
Исправлена ХРУ=0% Качественное исправление Невозможна свободная комплектация
Исправлена ХРУ=0%  Отсутствует или исправлена ХРУ=0% Исправлена ХРУ=0% Качественное исправление Возможна свободная комплектация

Преимущества достижения в микроскопе независимой аберрационной коррекции для всех отдельных оптических элементов - очевидны. Следует, однако, сделать замечание о возможном компромиссе в исправлении аберрации ХРУ в условиях визуального наблюдения на микроскопе, что может стать весьма существенным условием при проектировании ахроматических и апохроматических объективов. Согласно проведённым исследованиям отечественных специалистов, остаточная величина ХРУ в объективах больших увеличений остаточная ХРУ 0.8%-1% не будет существенно влиять на достоверность результатов при визуальном наблюдении [4].

Выводы:

  • Аберрация ХРУ в микроскопе вносит искажения в изображения фрагментов структур исследуемого объекта, поэтому её, безусловно, следует исправлять.
  • Качественное исправление этой аберрации возможно только до плоскости промежуточного изображения на микроскопе. Лучшим решением является исправление (или снижение) аберрации ХРУ в объективе.
  • Применение в микроскопе унифицированных узлов объективов и окуляров с полностью исправленной аберрацией ХРУ позволяет осуществлять т.н. «свободную» комплектацию при микроскопировании, используя сочетание тех или иных объективов и окуляров для получения требуемого масштаба изображения.

3. Обратимся к оптическим системам классических ахроматов Аббе, а также старых «цейссовких» апохроматов. Можно констатировать, что их оптические конструкции позволяют исправить ХРП, а при использовании оптических материалов (с аномальным значениями относительных частных дисперсий, например, флюорита или других кристаллов), возможно также снижение в ахроматах и исправление в апохроматах аберрации ВС. При этом в классических конструкциях Аббе отсутствуют элементы для полного исправления не только аберрации кривизны в изображении, но и ХРУ. Поэтому в таких объективах в изображении фрагментов исследуемых объектов всегда присутствует окраска.

Оригинальным приёмом для снижения ХРУ в объективах больших увеличений является использование в их оптических схемах линзовых афокальных компонентов. Такие элементы представляют собой плоскопараллельные пластинки типа дублет с радиусом склейки, из оптических материалов, имеющих одинаковые показатели преломления для одной из длин волн, но различные по спектру. Такое решение было предложено проф. Андреевым для объектива ОМ-41 (серийный ахромат ЛОМО 90х1.25 ми), появилась возможность снижения в два раза аберрации ХРУ в объективе, без изменения исходной коррекции остальных аберраций. Это решение, однако, не было использовано для серийного изготовления объективов, поскольку было уменьшено светопропускание объектива, а стоимость его изготовления увеличилась. Кроме того, конструкция объектива, в отличие от начальной, уже не могла соответствовать стандарту RMS, суммарная «толщина» оптической системы позволяла использовать только стандарт DIN, такой объектив потерял универсальность.

Оригинальным и самым распространённым в отечественной практике техническим решением стало добавление в исходную классическую схему ахромата или апохромата отрицательного длиннофокусного (близкого к афокальному) мениска, обращённого вогнутостью к пространству изображений и выполненного из оптического материала типа «тяжёлый флинт». Это решение было предложено инженером Фроловым и является развитием конструкции Богехольда, но именно совокупность всех перечисленных свойств мениска позволяет не только полностью исправлять аберрацию ХРУ в объективе, но и значительно снижать аберрацию кривизны в изображении. Такой элемент используется практически во всех современных отечественных объективах типа ОСХ, а также микрофлюарах типа ОФ больших увеличений [5], а оптические схемы объективов, с использованием такого компонента защищены несколькими патентами.

4. Если следовать всему изложенному выше, можно сформулировать технические требования при проектировании высокоапертурных (иммерсионных) ахроматических и апохроматических объективов для визуального наблюдения в биологических микроскопах. При достижении максимальных значений линейных увеличений 100х в изображении должны быть снижены в два раза аберрации кривизны и хроматической разности увеличений. Оптические конструкции не должны быть сильно усложнены в сравнении с классическими, предложенными Аббе. Небольшое количество линз в оптических схемах позволяет осуществить исполнение объективов в механических конструкциях в соответствии со стандартами RMS или DIN. Обеспечивается высокое светопропускание и малое количество рассеянного света. С технологической точки зрения такие конструкции пригодны для крупносерийного изготовления объективов, обеспечивая высокую воспроизводимость и стабильные показатели по качеству получаемого изображения.

Следующий рисунок иллюстрирует оптическую конструкцию и графики аберраций объектива ОХ100-1 (серийный стигмахромат ЛОМО 100х1.25 ми), в котором значения аберраций кривизны и ХРУ снижены в два раза (по сравнению с классическими ахроматами и апохроматами).

оптическая конструкция и графики аберраций объектива ОХ100-1

Использование приведённой оптической схемы позволило также провести оптический расчёт высокоапертурного объектива максимального увеличения с аберрационной коррекцией микрофлюар (полуапохромат), в котором достигнуты близкие к объективу ОХ-100-1 значения аберраций кривизны и ХРУ, при увеличении числовой апертуры и снижении величины вторичного спектра. Он получил наименование ОФ-100Л (микрофлюар ЛОМО 100х1.30 ми), и также изготавливается серийно, комплектуя отечественные люминесцентные биологические микроскопы.

Литература:

  1. Гейнц Аппельт «Введение в методы микроскопического исследования» Медгиз 1959
  2. О.А. Виноградова Автореферат диссертации на соискание степени кандидата технических наук С-Петербург 2006
  3. В.А. Панов, Л.Н.Андреев «Оптика микроскопов» Ленинград Машиностроение 1976
  4. Неопубликованная статья авторы Грамматин А.П., Ларина Р.М., Егорова О.В.
  5. Патент РФ 2087017
Последние новости

Участие в конференциях - это тоже своего рода работа, и тяжёлая. А раз это работа, мы должны отчитаться…

Опубликовано: 17.04.2019

Представляем новые модели оригинальных устройств, совмещаемых в рамках единой конструкции – микроскоп…

Опубликовано: 23.01.2019

В нашем проекте Labor-Microscopes™ завершены все мероприятия по разработке, изготовлению опытных образцов,…

Опубликовано: 24.09.2018

В связи с выполняемыми в нашем проекте работами по созданию универсального многофункционального микроскопа…

Опубликовано: 10.08.2018